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本试剂盒一次反应可完成单至多个DNA片段的重组，最快仅需5分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于95%。Mix中添加的辅助因子，有效提高克隆阳性率；经优化的反应体系，能够一定程度上耐受未纯化PCR产物中含有的杂质。升级版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。

• 实验流程概要
  
  
• 线性化克隆载体制备
  选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向PCR扩增完成。
  
  • 酶切制备
    一些限制性内切酶不能有效地消化超螺旋DNA，因此可能会留下不同数量的未切割载体DNA，降低阳性率。推荐使用LightFlash快速内切酶进行酶切（单酶切或者双酶切），使载体线性化完全，以降低转化背景（未切割的载体转化获得的假阳性克隆）。
    
    • 经酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，推荐使用双酶切。
      
    • 酶切完成后，建议将内切酶失活或对目的产物纯化后用于重组反应。
  • 反向PCR扩增制备
    为减少扩增突变的引入，推荐使用高保真PCR Mix进行扩增。推荐使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。
    
    • PCR产物无非特异性条带时，推荐使用质粒DNA消化酶(货号：BM0314)消化质粒模板即可用于重组反应；反之建议将PCR产物纯化后使用。
      
    • 多片段克隆时，建议将PCR产物纯化后使用。
• 插入片段PCR引物设计
  PCR引物的5'端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15～25nt（推荐18nt）序列。假如载体为粘性末端，且3'端突出，则引物设计必须包含突出部分；若5'端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。
  
  • 插入片段正向扩增引物：
    5'—上游载体末端同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列— 3'
    
  • 插入片段反向扩增引物：
    3'—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端同源序列—5'
  • 尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游25nt区域内GC含量为40%～60%时，重组效率最高；
  
  
  
  • 本试剂盒所提供的pUC 19载体（Ampr）连接端序列如下：
  
  
  
• 插入片段的PCR扩增
  推荐使用高保真PCR Mix进行扩增，以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的PCR产物进行无缝克隆反应，若PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接使用，但加样体积不应超过总反应体积的20%。
  
• 重组反应
  
  • 于冰水浴中配置以下反应体系，配制完成后，用移液枪轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡，切勿涡旋。
    

    组分	反应体系	阴性对照	阳性对照(如有必要)
    LightFlash DNA Assembly Mix Plus	5μL	5μL	5μL
    线性化载体①	50～200ng	50～100ng	线性化pUC19对照质粒，1μL
    插入片段②	10～200ng	-	500bp Control,Fragment,1μL
    ddH2O	至10μL

    注^①：最适载体用量(ng) = 0.02×载体碱基对数，即0.03pmol。
    注^②：插入单片段，最适片段用量（ng）= 0.04×片段碱基对数；插入多片段，每片段最适用量（ng）= 0.02×片段碱基对数。
    
    • 若插入单片段的长度大于载体，则应互换载体与插入片段用量；
      
    • 若插入片段的长度小于200bp，则插入片段应使用5倍载体用量；
      
    • 若按上述公式计算得到的用量超过最低/最高值，则建议直接按最低/最高用量使用；
      
    • 载体片段过长、插入片段过长或片段数过多，克隆阳性率均会降低。
  • 将反应体系置于50℃，反应5～60min。
    
    • 推荐使用PCR仪等温控比较精准的仪器进行反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低；
      
    • 插入1～2个片段时，推荐反应时间为5～15min；插入3～5个片段时，推荐反应时间为15～30min；
      
    • 当载体骨架在10kb以上或插入片段在4kb以上时，建议延长反应时间到30～60min；
      
    • 50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底。
  • 将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于-20℃。
    
    • -20℃储存的重组产物，建议在1周内使用。
• 重组产物转化
  取5～10μL反应液，加入到100μL感受态细胞中，缓慢吸打混匀，冰上放置30min。42℃热激45～60sec，冰浴5min。加500μL SOC或LB培养基，37℃振荡培养40～60min（200rpm）。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于37℃过夜培养。
  
  • 不同感受态细胞最后的克隆阳性率会有所差别，推荐使用转化效率> 10⁸ CFU/μg的感受态细胞；
    
  • 菌落数取决于PCR产物与线性化载体的数量和纯度；
    
  • 阳性对照平板通常生长大量白色单菌落，阴性对照平板只生长很少的菌落。
• 阳性克隆检测
  挑取单菌落至10μL ddH2O中混匀，95℃裂解10min后，取1μL裂解液作为模板，进行菌落PCR鉴定，或将单菌落接种至抗性培养基中培养过夜后，提取质粒进行酶切鉴定。
  阳性对照的阳性克隆检测，菌落PCR引物使用通用引物M13F与M13R，酶切鉴定用HindIII与EcoRI。
  
  • 菌落PCR时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果；
    
  • 必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。
    
  • M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
    M13R：CAGGAAACAGCTATGA